Cytogenetik

De cytogenetik (även cytogenetik , Cell Genetics ) är den gren av genetik att de kromosomer i första hand med ljusmikroskop analyseras. Antalet, formen, strukturen och funktionen hos kromosomerna undersöks, eftersom DNA från en kromosom som finns i cellkärnan innehåller det mesta av den levande varans genetiska information ( genomet ). Försök görs att knyta kromosom avvikelser med sina fenotypiska effekter.

Normal manlig karyotyp: tekniskt bandade metafaskromosomer (46, XY)

Fånga kromosomer

Både under meios i profas 1 (zygoten, pachyten, diploten, diakinese), metafas 1 och metafas 2, liksom under mitotiskt (pro) metafas, kan kromosomer identifieras individuellt och karyotypen kan skapas. Efter endoreplicering är förstorade kromosomer synliga i endometafaser och under hela cellcykeln som polyten-kromosomer . DNA-innehållet i en kromosom uppsättning avslöjar genomstorleken hos en organism, visar omfattningen av möjliga endoreplication och tillåter också selektiv endoreplication som skall mätas .

Längden på en stabilt ärftlig kromosomarm är begränsad av utsträckningen av spindelaxeln i anafasen. Det är därför elementen i en karyotyp ska förstås som fack i ett stort genom. Tidiga försök att bestämma antalet hos människor avslöjade 46 till 48 kromosomer; det fanns bara enighet om XX / XY-systemet för könsbestämning. Reproducerbara analyser på 1950-talet fick omfattande acceptans av den normala humana karyotypformeln 2n = 46.

Forskningshistoria

Theodor Boveri och Walter Sutton utvecklade oberoende kromosomteorin . Kort sagt står det: Enskilda kromosomer innehåller olika ärftliga faktorer ( gener ). Den polära separationen av de homologa kromosomerna i en bivalent sker i meios slumpmässigt och oberoende av den hos andra bivalenta. Genen för det bivalenta fördelas på motsvarande sätt slumpmässigt. Detta motsvarar reglerna för Gregor Mendel . Genen är "kopplade" inom de enskilda kromosomerna.

Metoder

Framgången med cytogenetik berodde på insikten att vävnad inte skulle skäras upp med en mikrotom , utan snarare att dess celler skulle separeras från varandra i hypotonisk lösning med fina nålar. Skonsam pressning skjuter kromosomerna i ett plan. Färgämnen som karmin , orcein eller Giemsa-blandningen förvandlar kromosomer till färgkroppar för att separera dem från cytoplasman . Detta lyckas särskilt tydligt med Feulgen-reaktionen ( Feulgen- proceduren), eftersom det specifikt fläckar det kromosomala DNA: t ( kärn-DNA ).

Skivor av mänsklig vävnad undersöks som en del av den patologiska rutinen. För att erhålla en bråkdel av intakta mitotiska cellkärnor för cytogenetiska problem, måste mikrotomen ställas in på en sektionstjocklek på 15 um.

Inducerat banding

De klassiska metoderna tillät emellertid inte de mänskliga (metafas) kromosomerna att otvetydigt differentieras. Detta var endast möjligt genom speciella bandtekniker på kärnor utan fas . Det fluorescerande färgämnet ( fluorokrom ) kinakrin skapar ett bandmönster som identifierar de enskilda kromosomparen. Karaktäristiska bandmönster uppstår också när DNA i kromosomerna är något denaturerad. Ett standardiserat system av förkortningar beskriver varje sektion av de tekniskt bandade kromosomerna. Den p står för petit (franska för litet) och betecknar den korta armen av en kromosom. Följande bokstav q valdes för den långa armen . På detta sätt kan inte bara onormala kromosomantal (såsom trisomi 21) bestämmas utan strukturella kromosomförändringar ( raderingar , duplikationer , translokationer ) kan också registreras.

Genaktivitet och replikering

För att studera interfasen i cellcykeln erbjöds levande celler radioaktivt märkta molekyler. Införlivande av 3 H- uridin , specifikt för RNA , visade genuttrycket av aktiva kromosomala platser. Inkorporering av 3 H- tymidin , specifik för DNA, visade kromosomal DNA-syntes i S-fasen. Som betastrålning lämnade elektroner var och en sina spår som autoradiografi i en film placerad på cellerna.

  • I senare replikationsanalyser ersatte bromodeoxiuridin det radioaktivt märkta tymidinet.
  • Avancerad genteknik gjorde också radioaktiva ämnen överflödiga när det gäller frågor om genaktivitet. Detektionen skiftar från transkriptionsnivån (RNA-syntes) till den fullständiga translationen : platsen och tiden för aktivering av en genspecifik promotor indikeras av det protein som produceras av reportergenen . Som en förutsättning måste reportergenens DNA-sekvens fästas efter promotorsekvensen för genen som ska undersökas. En organism transformeras med denna DNA-konstruktion . Reportergenen, som kodar för det gröna fluorescerande proteinet (GFP), är populär. Detta system kan användas för att spåra genuttryck i celler, vävnader och organ.

Restriktionsenzymer

Isoleringen av många DNA-restrikaser representerade ett revolutionerande och bestående genombrott inom cytogenetik och genetik i allmänhet. Dessa enzymer, mestadels erhållna från bakterier, är molekylära saxar : De skär upp DNA med korta, definierade bassekvenser. Restrikaserna och polymeraskedjereaktionen (PCR) är de två pelarna i modern molekylär genetik och genteknik . De tillåter att hela genom sekvenseras eller att olika typer av fluorescens in situ hybridisering ( FISH ) utförs. För de senare markeras DNA- eller RNA-prover med fluorokromer och hybridiseras till komplementära DNA-sekvenser av de riktade kromosomerna . Ett fluorescensmikroskop krävs för diagnos .

Interfas- Zytogenetik eller Molekularzytogenetik: genom fluorescens in situ hybridisering visualiserad kromosomal translokation t (9; 22)

Kromosomer målade med FISK

För "måla" flera sonder samtidigt ( engelska sonder ), med olika fluorokrom märkta, hybridiserade till metafas. Varje kromosompar i karyotypen får sin egen färgton genom kromosommålning . Det finns två sätt att göra detta.

  • Flerfärgad (multiplex) fluorescens in situ hybridisering ( M-FISH ). Ett motsvarande stort antal digitala bilder registreras av ett metafas dekorerat med olika fluorokromer. Ett datorprogram analyserar originalinspelningarna och kombinerar dem i en enda bild som visar kromosompar i lätt urskiljbara falska färger . Metoden är också idealisk för att visa kromosommutationer i interfascellkärnor (bild: interfascytogenetik).
  • Spektral karyotypning ( SKY ). Denna typ av kromosommålning kräver kraftfulla datorer. Eftersom två partiella strålar produceras från varje pixel i den digitala bilden, som bringas till störningar med hjälp av en interferometer med en vägskillnad. En Fourier-transformation ger exakta data om det ursprungliga fluorescerande spektrumet från interferogrammet . Från detta genererar ett nedströms datorprogram i sin tur lätt urskiljbara falska färger för de enskilda kromosompar i karyotypen. Som en Fourier-spektroskopi erbjuder SKY fördelen över M-FISH med större avstånd mellan kromosomala signaler och brus .

Dubbel hybridisering

Den kromogena in situ-hybridiseringen ( CISH , inklusive: Dual ISH) är ett billigt alternativ för FISH. Den används för att söka efter en specifik mutation på en specifik kromosom. Jämfört med FISH erbjuder CISH flera fördelar: Användning av två stabila, absorberande färger som inte bleker; Diagnos i Brightfield-mikroskopet, snabbare och billigare. Fråga i bröstcancer och andra solida tumörer: Förstärks HER2-genen på kromosom 17q12 för receptor 2 av human epidermal tillväxtfaktor? För att göra detta hybridiseras HER2 DNA-provet med den första färgen på en cellkärna i interfas. Med den andra färgen hybridiseras CEN-17 samtidigt som referens-DNA för centromeren i kromosom 17. Förhållandet 2 eller högre betyder HER2- förstärkning i kombination med en dålig medicinsk prognos .

Genom i jämförelse

Jämförande genomisk hybridisering ( CGH ) detekterar kvantitativa sekvensförändringar i ett genom mer känsligt än FISH. För CGH är DNA från celler som ska undersökas markerat med ett första fluorokrom. DNA från normala celler är också markerat med en andra fluorokrom med olika emissionsvåglängder . Prov-DNA och referens-DNA hybridiseras för att sprida, normala metafaser samtidigt i lika stora mängder. ”Normal” betyder, så vitt det är känt, en frisk organism som givare. I CGH "kämpar" de två DNA: erna (tävlar) om samma bindningsställen i målkromosomerna. Den komplexa fluorescensen mäts längs metafaskromosomerna. Om båda DNA-proverna matchar är deras förhållande 1,0. Den första fluorokromen (bunden till DNA-provet) ger ett värde på 1,5 vid duplikationer i en kromosom. Om båda homologa kromosomerna fördubblas på samma plats är värdet 2,0. Vid strykningar i en kromosom ( förlust av heterozygositet ) är värdet 0,5. Om båda homologa kromosomerna raderas är värdet 0,0 (ingen signal från det första fluorokromet). Molekylär cytogenetik, även känd som CGH, kan analysera en enda cellkärna eller avslöja DNA-skillnaderna mellan de två könsbundna kromosomerna.

Cellkärnor och siffror

Enkelt att räkna

Antalet mitotiska eller meiotiska kromosomer är konstant för en art och dess individer: "Könscellerna (ägg eller spermatozoën) i en organism innehåller hälften så många kromosomer som den första embryonala cellen från vilken denna organism uppstod." Detta konstanta antal är en arter som är karakteristiska. Den enkla (haploida) nummer n är vanligtvis härledd från 2n kromosomer av en mitotisk metafas. Eftersom i könscellernas faktiskt haploida kärnor kan inte kromosomerna räknas direkt. Men när bivalenterna parar sig genom chiasmata, visar meios I 1n- kromosomer.

Mät längder

”Kromosomerna är i grunden bilaterala symmetriska eller asymmetriska strukturer.” Denna mening inspirerade många mätningar för att bestämma längden på kromosomer och förhållandet mellan deras korta och deras långa armar. Kinetokorns position klassificerar en symmetrisk kromosom som metacentrisk och en asymmetrisk som submetacentrisk , subtelocentrisk eller accentric . Positionen för en sekundär sammandragning som nukleolusarrangörregionen ska också definieras numeriskt. Sådana längdmätningar gör det möjligt att diagnostisera en kromosoms identitet i en karyotyp med relativt få element.

Väg cellkärnor

  • Mikrofotometri (även fotomikrometri , mikroskopfotometri eller cytometri ). Denna teknik används främst för att bestämma DNA-halten i hela cellkärnor och även deras kromosomer. Arbetet i det synliga spektrumet visade sig vara det mest praktiska. Efter att kärn-DNA har färgats med Feulgen-proceduren mäts absorptionsmaximum (560 nm). För att omvandla de resulterande absorptionsenheterna till pikogram (pg) eller megabaspar (Mbp) måste också referenskärnor med känt DNA-innehåll registreras. Processen är tidskrävande. Det kräver noggrann förberedelse på glasskivor ( bildbaserad mikrofotometri ), men erbjuder fördelen att kunna upprepa mätningar och bedöma sammanhängande vävnadsdelar och celltyper. Ett banbrytande arbete definierade värdet 1 C som DNA-innehållet i (haploida) genomet hos en art.
  • Flödescytometri (även kallad pulscytofotometri ). För detta förfarande är cellstrukturen i en vävnad helt upplöst och cellerna eller deras kärnor färgas vanligtvis med fluorokromer. Det har fördelen att analysera stora prover på kort tid.

litteratur

Tidningar

webb-länkar

Individuella bevis

  1. ↑ Ingo Schubert, JL Oud: Det finns en övre gräns för kromosomstorlek för normal utveckling av en organism. I: Cell . Volym 88, 1997, s. 515-520.
  2. Von Hans von Winiwarter: Études sur la spermatogenese humaine. I: Archives de Biologie (Liège) Volym 27, nr 93, 1912, s. 147-149.
  3. ^ Theophilus S. Painter : Studier i spermatogenes hos däggdjur, II. Människans spermatogenes. I: Journal of Experimental Zoology Volume 37, 1923, s. 291-336, 1923.
  4. H TC Hsu: Däggdjurskromosomer in vitro, I. Karyotypen hos människan. (PDF) I: Journal of Heredity Volym 43, 1952, s. 167-172.
  5. ↑ Joe Hin Tjio, Albert Levan: Kromosom Antalet människan. I: Hereditas Volym 42, 1956, s. 1-6.
  6. ↑ Theodor Boveri : Om multipolära mitoser som ett sätt att analysera cellkärnan. I: Verh Phys-Med Ges Würzburg Volym NF 35, 1902, s 67-90, s 81.
  7. ↑ Walter Sutton Stanborough: Kromosomerna i ärftlighet. I: Biol Bull Marine Biol Labor Woods Hole (Mass.) Vol. 4, 1902 (eller 1903), s. 231-248.
  8. Üd Rüdiger G. Steinbeck, Gert U. Auer, Anders D. Zetterberg: Tillförlitlighet och betydelse av DNA-mätningar i mellanfaskärnor och delningsfigurer i histologiska sektioner. I: European Journal of Cancer Volym 35, nr 5, 1999, s. 87-795.
  9. Bj Torbjörn Caspersson , Lore Zech, C. Johansson: Differentiell bindning av alkylerande fluorokromer i mänskliga kromosomer. I: Experimental Cell Research Volume 60, 1970, s. 315-319.
  10. ^ Wolfgang Schnedl: Analys av den mänskliga karyotypen med hjälp av en återassociationsteknik. I: Chromosoma Volume 34, 19971, s. 448-454.
  11. ↑ JJ Yunis: Hög upplösning av mänskliga kromosomer. I: Vetenskap . Volym 191, nummer 4233, mars 1976, s. 1268-1270, PMID 1257746 . doi : 10.2307 / 1741162 (för närvarande inte tillgänglig) .
  12. Sh LG Shaffer, J. McGowan-Jordan, M. Schmid (red.): ISCN 2013. Ett internationellt system för human cytogenetisk nomenklatur (2013): Rekommendationer från den internationella ständiga kommittén för human cytogenetisk nomenklatur, publicerad i samarbete med "Cytogenetic and Genome Research "plus utfällning:" The Normal Human Karyotype G- and R-bands ". Karger, Basel 2012. ISBN 978-3-318-02253-7 .
  13. ↑ Claus Pelling: Kromosomal syntes av ribonukleinsyra som visas genom inkorporering av Uridin märkt med tritium. (PDF) I: Nature Volume 184, 4686, 1959, s. 655-656, 1959.
  14. ↑ James Herbert Taylor , Philip S. Woods, Walter L. Hughes: Organisationen och duplicering av No. kromosomer såsom avslöjats genom autoradiografiska studier med användning av tritiummärkt tymidin. I: PNAS Volym 43, 1957, s. 122-128. PMC 528395 (fri fulltext)
  15. ↑ SR Kain, M. Adams, A. Kondepudi, TT Yang, WW Ward, P. Kitts: Grönt fluorescerande protein som en reporter av genuttryck och proteinlokalisering. I: BioTechniques Volym 19, nr 4, 1995, s. 650-655.
  16. ↑ Werner Arber , S. Linn: DNA-modifiering och begränsning. I: Annual Review of Biochemistry Volume 38, 1969, s. 467-500. ISSN  0066-4154 (tryck), ISSN  1545-4509 (elektroniskt).
  17. ↑ Hamilton O. Smith, KW Wilcox: Ett restriktionsenzym från Hemophilus influenzae, I. Rening och allmänna egenskaper. I: Journal of Molecular Biology Vol. 51, nr 2, 1970, s. 379-391. ISSN  0022-2836 (Print), ISSN  1089-8638 (Electronic).
  18. ↑ K. Danna, Daniel Nathans: Specifik klyvning av simianvirus 40 DNA genom restriktionsendonukleas av Hemophilus influenzae. I: PNAS Volym 68, nr 12, 1971, sid 2913-2917. PMC 389558 (fri fullständig text)
  19. ↑ Werner Arber: Begränsningsendonukleaser. I: Angewandte Chemie (International Edition på engelska) Volym 17, nr 2, 1978, s 73-79. ISSN  1433-7851 (tryck), ISSN  1521-3773 (elektroniskt).
  20. ^ Richard J. Roberts: Hur restriktionsenzymer blev molekylärbiologins arbetshästar. I: PNAS Volym 102, nr 17, 2005, s. 5905-5908. PMC 1087929 (fri text)
  21. ↑ Thomas Ried, Evelin Schröck, Yi Ning, Johannes Wienberg: Kromosommålning: en användbar konst. I: Human Molecular Genetics Volym 7, nr 10, 1998, s. 1619-1626.
  22. ↑ Michael R. Speicher, David C. Ward: Färgning av cytogenetik. I: Nature Medicine Vol. 2, nr 9, 1996, s. 1046-1048, 1996. doi : 10.1038 / nm0996-1046 .
  23. ↑ Evelin Schröck, S. du Manoir, T. Veldman, B. Schoell, J. Wienberg, MA Ferguson-Smith, Y. Ning, DH Ledbetter, I. Bar-Am, D. Soenksen, Y. Garini, Thomas Ried: Flerfärgad spektral karyotypning av mänskliga kromosomer. I: Science Volym 273, nr 5274, 1996, s. 494-497. doi : 10.1126 / science.273.5274.494 .
  24. ↑ H. Parsche, K. Luchner: Moderna metoder för spektralanalys. I: Physics in our time, Volym 6, 1975, s. 151-161. Online ISSN  1521-3943 .
  25. S Lim Sung-Jig, Alegria Cantillep, Philip M. Carpenter: Validering och optimering av arbetsflöde vid testning av human epidermal tillväxtfaktorreceptor 2 med användning av INFORM HER2 dubbel-färg in situ-hybridisering. I: Human Pathology Vol. 44, nr 11, 2013, s. 2590-2596.
  26. ↑ J. Mollerup, U. Henriksen, S. Müller, A. Schønau: Dubbelfärg kromogen in situ-hybridisering för bestämning av HER2-status i bröstcancer: En stor jämförande studie med nuvarande toppmodern fluorescens in situ-hybridisering. I: BioMed Central Clinical Pathology Volym 12, 2012, s.3.
  27. ↑ Anne Kallioniemi, Olli-P. Kallioniemi, Damir Sudar, Denis Rutovitz, Joe W. Gray, Fred Waldman, Dan Pinkel: Jämförande genomisk hybridisering för molekylär cytogenetisk analys av solida tumörer. I: Science Volym 258, nr 5083, 1992, s. 818-821.
  28. ^ Olli-P. Kallioniemi, Anne Kallioniemi, Damir Sudar, Denis Rutovitz, Joe W. Gray, Fred Waldman, Dan Pinkel: Jämförande genomisk hybridisering: En snabb ny metod för att detektera och kartlägga DNA-amplifiering i tumörer. I: Seminars in Cancer Biology Volume 4, 1993, s. 41-46.
  29. ↑ Evelin Schröck et al. : Jämförande genomisk hybridisering av humana maligna gliom avslöjar flera amplifieringsställen och icke-slumpmässiga kromosomala vinster och förluster. I: The American Journal of Pathology Volym 144, nr 6, 1994, s. 1203-1218. PMC 1887475 (fri fullständig text)
  30. ↑ Christoph A. Klein, O. Schmidt-Kittler, JA Schardt, K. Pantel, MR Speicher, Gert Riethmüller: Jämförande genomisk hybridisering, förlust av heterozygositet och DNA-sekvensanalys av enstaka celler. I: Proceedings of the National Academy of Sciences USA Vol. 96, nr 8, 1999, s. 4494-4499. PMC 16360 (fri fullständig text)
  31. ↑ Walther Traut, Ulrike Eickhoff, Jan-C. Schorch: Identifiering och analys av könskromosomer genom jämförande genomisk hybridisering (CGH). I: Methods in Cell Science Volume 23, 2001, s. 155-161.
  32. ↑ Theodor Boveri: Cellstudier (3): Om den kromatiska kärnämnets beteende vid bildandet av riktningskropparna och i befruktningen. I: Jenaische Zeitschrift für Naturwissenschaft Volym 24, 1890, s. 314–401. Där s. 372f.
  33. ↑ Georg Tischler: Kromosomnummer - form och individualitet i växtriket. I: Progress of Botany Volume 5, 1915, s. 172–284.
  34. ^ Emil Heitz : Den bilaterala konstruktionen av könskromosomer och autosomer i Pellia fabbroniana, P. epiphylla och några andra Jungermanniaceen. I: Planta Volym 5, 1928, s. 725-768. Där s. 764.
  35. ↑ Helmut Zacharias, Boris Anokhin, Konstantin Khalturin, Thomas CG Bosch : Genomstorlekar och kromosomer i basalmetazoanen Hydra. I: Zoology Volume 107, 2004, s. 219-227.
  36. ↑ Hewson Swift : beständigheten hos desoxiribosnukleinsyra i växtkärnor. I: PNAS Volym 36, nr 11, 1950, s. 643-654. PMC 1063260 (fri fulltext)
  37. ↑ J. Kusenda, M. Fajtova, A. Kovarikova: Övervakning av minimal kvarvarande sjukdom vid akut leukemi genom multiparametrisk flödescytometri. I: Neoplasma Volym 61, nr 2, 2014, s 119–127. doi : 10.4149 / neo_2014_017 . Se meny: 2014 .